Holbein estuvo establecido en su ciudad natal desde 1494 e irradió un gran influjo por toda Alemania meridional como apreciadísimo pintor de retablos; se le encuentra en Ulm (1499), en Frankfurt (1501; retablo de los Dominicos, en el museo), y en Issenheim (1517), donde se estableció definitivamente.
Entre sus obras religiosas, pintadas al estilo tradicional alemán, sobresalen los retablos de las basílicas de Santa María la Mayor (Roma) y de San Pablo de Augsburgo (museo de Augsburgo), las Escenas de la vida de la Virgen (catedral de Augsburgo); La muerte de la Virgen rodeada de los apóstoles (Basilea); el retablo deKaisheim, con escenas de la Pasión (1502, Munich); el Altar de San Sebastián (1516, Munich), que lleva su autorretrato; La fuente de la juventud (1519, Lisboa).
Holbein ha dejado retratos de gran realismo (Retrato de mujer, a Basilea) entre los que destacan los de sus hijos y discípulos Ambrosius y Hans Holbein el Joven (dibujos a lápiz, 1511, Berlín).